ONTWIKKELING VAN DRAGERSCHAPSTESTEN VOOR AMYLOIDOSE EN POLYCYSTEUZE NIERZIEKTE BIJ DE KAT
Projectplan
1. Beschrijving van de organisatie.
Het project wordt aangevraagd door en zal uitgevoerd worden op de Hoofdafdeling Geneeskunde van Gezelschapsdieren van de Faculteit Diergeneeskunde van de Universiteit Utrecht. Deze Faculteit houdt zich bezig met onderzoek op het terrein van de gezondheid van huisdieren en met onderwijs in de Diergeneeskunde. Daarnaast hebben zij o.a. via de Dierenkliniek van de Faculteit een belangrijke patiëntenzorgtaak Deze aanvraag is opgesteld in nauwe samenwerking met de stichting Overlegplatform van de Nederlandse Cat Fancy. De Stichting is de overkoepelende organisatie voor alle 14 Nederlandse raskattenverenigingen. Volgens de bekende statistische gegevens bestaat de totale kattenpopulatie in Nederland uit circa 2.300.000 dieren. Hiervan zijn ongeveer 240.000 raskatten binnen de participerende verenigingen geregistreerd. De Nederlandse raskattenverenigingen begeleiden het fokken, houden, tentoonstellen en keuren van de raskatten van de leden van hun verenigingen. De verenigingen onderhouden naast het organiseren van eerder genoemde activiteiten het contact met hun leden door de uitgifte van verenigingsperiodieken, totaal circa 10.000 exemplaren. Aan de gezondheid- en welzijnsaspecten van de raskatten wordt binnen de verenigingen groot belang gehecht.
2. Doelstelling van het project.
Het project is gericht op het kennen van de moleculaire oorzaak van de aanleg voor amyloïdose bij de Siamees, Oosterse Korthaar en de Abessijn, en polycysteuze nierziekte bij de Pers. Op basis van de kennis omtrent het defect in het DNA zal een laboratoriumtest voor dragerschap worden ontwikkeld. De test zal aan de fokkers worden aangeboden. Implementatie van de testresultaten in het fokprogramma zal resulteren in het terugdringen van deze ziekte. Ook bij niet raskatten zijn deze afwijkingen geconstateerd. Hierdoor worden de uitkomsten van het onderzoek van direct belang voor alle katten.
3. Achtergrond
Waarom een DNA-test? Erfelijke ziekten liggen altijd op de loer bij welk fokkerijsysteem dan ook. In de wereld van productiedieren zijn uitgebreide en doeltreffende fokprogramma’s om de incidentie van erfelijke ziekten in de hand te houden. In de wereld van de liefhebberij fokkerij zijn dergelijke fokkerijprogramma’s absoluut geen realistische optie, tenzij er een goed testsysteem voorhanden is. DNA testen voldoen aan deze eis omdat hiermee ondubbelzinnig kan worden aangetoond of dieren de ziekte al of niet door kunnen geven. In de hondenfokkerij begint toepassing van DNA testen al van de grond te komen. Recent zijn ook voor de kat deze “gereedschappen”, te weten een genetische kaart, een stralingshybride panel en een bank van grote genomische klonen, een zogenaamde BAC bank, beschikbaar gekomen.
Amyloïdose
>In de wereld van kattenfokkers is grote ongerustheid ontstaan omdat amyloïdose werd ontdekt bij veel gebruikte fokdieren. Bij de Abessijn is vooral nieramyloïdose gezien, terwijl aantasting van de lever meer bij de Siamees is waargenomen. Amyloïdose wordt gekenmerkt door een afwijking in de eiwitstofwisseling, waardoor pathologisch gekristalliseerde varianten van cel- of bloedeiwit extracellulair wordt afgezet. Deze amyloïdafzettingen bestaan uit amyloïdfibrillen die een bèta vouwbladstructuur hebben. Ze kunnen in veel organen voorkomen en kunnen uit verschillende eiwitten bestaan. Bij de Siamees gaat het voornamelijk over serumamyloïd A (SAA) afzetting in de lever en bij de Abessijn over SAA afzetting in de nier. Vanwege de pas op latere leeftijd optredende symptomen is bestrijding van de ziekte door uitsluiting van de lijderdieren zeer moeizaam. Een alternatief zou kunnen zijn om de lijnen waarin de aandoening voorkomt geheel uit te sluiten van de fokkerij. Voor dit alternatief is moeilijk een draagvlak te scheppen omdat dan immers ook veel gezonde dieren, die geen aanleg voor deze ziekte hebben, van de fokkerij zullen moeten worden uitgesloten. Daarnaast kleeft aan het uitsluiten van een groot aantal lijnen het reële gevaar dat de genetische basis van de populatie dusdanig versmald wordt dat andere erfelijke ziekten de kop op zullen steken. Het onderzoek zal er dan ook op zijn gericht de mutatie via moleculair-genetisch onderzoek op te sporen, hiervoor een test te ontwikkelen en die toe te passen om de ziekte terug te dringen.
Polycysteuze nierziekte bij de Perzische kat.
Bij het Perzische kattenras is een autosomaal dominant overervende polycysteuze nierziekte (PKD) een zeer groot probleem. De cysten (vochtblaasjes) ontstaan uit ductuli (afvoerbuisjes) in de nieren. Hoewel de cysten al op een vroege leeftijd met echografisch onderzoek zichtbaar gemaakt kunnen worden treedt het klinisch ziektebeeld pas vele jaren later op. Dit komt omdat het een progressieve ziekte is. Met de leeftijd kunnen het aantal en de grootte van de cysten toenemen, waardoor nierfalen kan ontstaan. Het ziektebeeld bij de Perzische kat vertoont veel overeenkomsten met dat bij de mens. Bij de mens is de erfelijke basis al opgehelderd en zijn genetische DNA testen ontwikkelt. Het betreft fouten in twee genen die op verschillende chromosomen gelegen zijn maar een vergelijkbare structuur hebben, ze worden polycystin 1 en polycystin 2 genoemd. Als één van deze twee genen defect is dan ontstaat de nierziekte. De precieze werking van de eiwitten is nog niet opgehelderd maar het is waarschijnlijk dat ze een rol spelen bij de inbedding van de niercellen in het omliggende bindweefsel. Uit proeven met muizen is gebleken dat als er helemaal geen polyscystine1 kan worden gevormd er geen levensvatbare vrucht ontstaat. Men stelt zich het ziekteproces als volgt voor: Bij drager dieren (één van de twee chromosomen heeft een functionerend gen) valt gedurende het leven het andere gen in sommige niercellen ook uit. Deze cellen ontregelen dan de cellulaire weefselorganisatie en elke cyste kan gezien worden als het gevolg van zo een ontaarde niercel. Het ligt zeer voor de hand om nu na te gaan of één van de polycystine genen betrokken is bij de polycysteuze nierziekte bij het Perzische kattenras. Alhoewel de ziekte goed gediagnosticeerde kan worden door een dierenarts-specialist radiologie is de ontwikkeling van een DNA test toch zeer gewenst. Het uitsluiten van dragerschap voor cysten kan pas op vanaf een leeftijd van 6 maanden en dan nog is dit niet absoluut zeker. Met een DNA test kan dragerschap al vanaf de geboorte worden vastgesteld of uitgesloten en bestaat vrijwel absolute zekerheid omtrent de uitslag.
4. Projectbeschrijving
Het doel is het aanbieden van een laboratoriumtest voor de aanleg tot amyloïdose en polycysteuze nierziekte. Hiervan kunnen fokkers gebruik maken voor selectie van hun fokdieren. Het uiteindelijke doel is het totaal verdwijnen van deze ziekten uit de kattenpopulaties. Het onderzoek bestaat uit een drietal te onderscheiden aspecten waarvan met het eerste deel al sinds medio 1997 een aanvang is gemaakt.
Verzamelen van familiemateriaal.
Van katten waarbij klinisch en/of pathologisch amyloïdose of polycysteuze nierziekte is gediagnosticeerd zijn/worden de stambomen verzameld en is/wordt bloed afgenomen. Ook zal van ouders en nestgenoten de gezondheidsstatus worden bepaald en bloed worden afgenomen. Uit de bloedmonsters zal DNA worden gewonnen. Tot op heden zijn in samenwerking met de Cat Fancy van 34 Abessijnse katten, van 61 Siamese katten van van 62 Perzische katten bloedmonsters verzameld. Al de dieren zijn òf zelf lijder òf zijn daaraan nauw verwant. Vanuit de hele wereld zijn al gevallen van amyloïdose bekend en wordt bloed voor onderzoek aangeboden.
Analyse van kandidaat genen.
Voor genen die mogelijk oorzakelijk betrokken zijn bij amyloïdose en polycysteuze nieren zullen polymorfe markers worden geïdentificeerd. Dit kan op twee manieren gedaan worden. Ten eerste zullen genomische klonen van de kat voor deze genen worden geïsoleerd. We kunnen hiervoor gebruik maken van een genomische BAC DNA bank van de kat die in het laboratorium van Dr. P. De Jong in Buffalo USA is gemaakt. Eerder heeft zijn groep al een dergelijke BAC bank voor de hond aan ons ter beschikking gesteld, die we al met veel succes hebben toegepast(van de Sluis et al, 1999, Lantinga et al 2000 2x. Voor amyloïdose zal begonnen worden met het zeer recent geïdentificeerde gen verantwoordelijk voor Familiaire Middellandse Zeekoorts (The French FMF consortium, 1998) en het gen voor Serum Amyloid A (SAA). In dit laatste gen zijn voor verschillende rassen veranderingen gevonden die mogelijk te maken kunnen hebben met het optreden van amyloïdose (van der Linde-Sipman et al, 1997). Voor polycysteuze nierziekte zullen de polycystine genen worden nagekeken. Deze genen coderen voor eiwitten die voor de hechting tussen niercellen en de niermatrix zorgen en gemuteerd zijn in polycysteuze nierziekte bij de mens (European Polycystic Kidney Disease Consortium: 1994; Mochizuki et al, 1996). De te identificeren BAC clones zullen worden toegewezen aan één van de kattenchromosomen. Daarnaast zullen ze geplaatst worden op de Radiation Hybrid map van de kat die recent is gepubliceerd (Murphy et al, 1999). Met één of beide methodes kunnen dan reeds bekende polymorfe markers geïdentificeerd worden (zie sectie 3). Indien dit niet direct mogelijk is dan zullen we in de BAC’s zelf zoeken naar polymorfe markers. Hiermee hebben we in het kader van de verschillende onderzoeksprojecten al veel positieve ervaring opgedaan. De overerving van de aldus geselecteerde polymorfe markers zal worden bepaald in het verzamelde familiemateriaal. Indien de polymorfe marker niet in de directe nabijheid van het ziektegen ligt dan zal het in 50% van de nakomelingen niet samen overerven. Op deze wijze is dus heel snel duidelijk te bepalen dat een kandidaat gen niet betrokken is bij het ziektebeeld. Indien de marker wel samen overerft met de ziekte dan zal het daarbij behorende gen nagekeken worden op mutaties die de ziekte kunnen verklaren.
Totale genoom scan. Indien niet voor één van de kandidaatgenen een verband met de aanleg voor amyloïdose of polycysteuze nierziekte kan worden vastgesteld, dan zal de overerving van anonieme DNA markers verspreid over het genoom worden bepaald. Er zijn momenteel 253 DNA markers verdeeld over het gehele genoom van de kat beschreven (Menotti-Raymond et al, 1999).Indien we een gebied vinden dat samen overerft met de ziekte dan zullen we op basis van de vergelijkende cytogenetische kaart van de mens en de kat bepalen welke genen in dit gebied liggen en welke van die genen een kandidaatgen zullen zijn (bijvoorbeeld omdat ze een vergelijkbare structuur hebben als de eerder geïdentificeerde genen of omdat ze specifiek in lever of nier tot expressie komen
Literatuur:
Lantinga-van Leeuwen IS, Mol J, Kooistra HS, Rijnberk A, Breen M, Renier C, van Oost BA: Cloning of the canine gene encoding transcription factor Pit-1 and mutation Analysis in a canine model of pituitary dwarfism. Mammalian Genome 11, 31-36 (2000)
Lantinga-van Leeuwen IS, Kooistra HS, Mol JA, Renier C, Breen M, van Oost BA: The canine Prop1 gene: Genomic structure, mapping, and evaluation as a candidate gene for combined pituitary hormone deficiency in German shepherd dogs. Cytogenet Cell Genet, in press.
Menotti-Raymond M, David VA, Lyons LA, Schäffer AA, Tomlin JF, Hutton MK, O’Brien SJ: A Genetic Linkage Map of Microsatellites in the Domestic Cat (Felis Catus), Genomics 57, 9-23 (1999).
The French FMF consortium: A candidate gene for familial Mediterranean fever. Nature Genetics 17, 25-31 (1998).
Mochizuki T, Wu G, Haashi T, Xenophontos SL, Veldhuisen B, Saris JJ: PKD2, a gene for polycystic kidney disease that encoded an integral membrane protein. Science 272, 1339-1342 (1996).
Murphy WJ, Menotti-Raymond M, Lyons LA, Thompson MA, O’Brien SJ: Development of a Feline Whole Genome Radiation Hybrid Panel and Comparative Mapping of Human Chromosome 12 and 22 Loci. Genomics 57, 1-8 (1999).
The European Polycystic Kidney Disease Consortium: The polycystic kidney disease 1 gene encodes a 14 kb transcript and lies within a duplicated region on chromosome 16. Cell 77, 881-894 (1994)
van der Linde-Sipman JS, Nieuwold TA, Tooten PCJ, de Neijs-Backer M, Gruys E: Generalized AA-amyloidosis in Siamese and Oriental cats. Vet-Immunol-Immunopathol 56, 1-10, 1997.
van de Sluis BJA, Breen M, Nanji M, van Wolferen M, de Jong P, Binns MM, Pearson PL, Kuipers J, Rothuizen J, Cox DW, Wijmenga C, van Oost BA: Genetic mapping of the Copper toxicosis locus in Bedlington terriers to dog chromosome 10, in a region syntenic to human 2p13-16. Hum Molec Genet 8, 501-7 (1999
5. Ontwikkeling en implementatie van een DNA test.
Als de mutatie wordt gevonden zal een routinematig uit te voeren test worden ontwikkeld. Hiermee is voor andere gendefecten bij mens en hond al ruime ervaring verkregen. Met behulp van een steekproef onder dieren die volgens het stamboek bepalend zijn geweest voor de verschillende lijnen zal inzicht in de frequentie van de mutatie in de populatie worden verkregen. De fokkers kunnen dan bij elke voorgenomen paring met DNA-onderzoek van poes en kater nagaan of de voorgenomen combinatie nakomelingen zal voortbrengen met amyloïdose of polycysteuze nierziekte. Daarmee kan effectief worden voorkomen dat de ziekte zich verder in de populatie verspreidt.
6. Communicatieplan
De resultaten van het onderzoek zullen worden gepubliceerd in internationale wetenschappelijke vaktijdschriften. Het is de bedoeling dat dit onderzoek uitmondt in een dissertatie. Daarnaast zal door middel van enkele publicaties, bedoeld voor de Nederlandstalige bladen voor kattenliefhebbers (met 10.000 abonnees) aandacht worden besteed aan de opzet, het verloop en de resultaten van het project. De informatieoverdracht naar de doelgroep van fokkers is een essentieel onderdeel van het project, waaraan de nodige energie zal moeten worden gegeven. Dit zal geschieden in nauw overleg met de klankbordgroep. Aandacht zal moeten worden besteed aan het verspreiden van de nieuwe inzichten in de moleculaire genetica en de nieuwe mogelijkheden die daaruit voortvloeien.
7. De effecten
Het effect zal optimaal zijn als een test voor de verandering in het DNA die verantwoordelijk is voor de aanleg voor amyloïdose of polycysteuze nierziekte kan worden ontwikkeld. Fokkers kunnen dan de dieren die ze geselecteerd hebben om verder mee te fokken vooraf testen op dragerschap. Deze test kan dan door de kattenverenigingen verplicht gesteld worden. Zoals hiervoor is toegelicht is de mate van voorkomen van de mutatie van belang of direct alle dragers van de fokkerij moeten worden uitgesloten of dat een meer geleidelijke strategie moet worden gevolgd.
8. De risico’s
Zoals bij elk project met een component van wetenschappelijk onderzoek zijn de resultaten onvoorspelbaar. Dit geldt zeker voor de evaluatie van mogelijke kandidaatgenen. Wat een, qua frequentie, belangrijk gen bij de mens is, hoeft dat nog niet bij de kat te zijn. Dit omdat het ontstaan van amyloïdose de resultante is van een uiteindelijk niet goed gecoördineerd samenspel van een aantal genen in reactie op een “omgevingstrigger”. Elk van deze genen zou amyloïdose kunnen veroorzaken en het is een kwestie van toeval welk gen bij welk ras/diersoort het betreft. Daarom is als tweede onderzoeksstrategie de analyse van anonieme DNA markers genomen. Deze aanpak is erop gericht het chromosomale gedeelte dat mee overerft met de ziekte te vinden. Met betrekking tot de beschikbaarheid van de te onderzoeken katten denken wij, gezien de respons op onze oproepen tot nu toe, geen problemen te hoeven verwachten.
Projectgroep en klankbordgroep
Het onderzoek zal worden uitgevoerd door een voor vier jaar full time aan te stellen Assistent in Opleiding (AIO) met moleculair-biologische ervaring (vacature). Hij of zij zal werken onder het dagelijks toezicht van projectleider Prof. Dr.B. A. van Oost.
Projectgroep
——————————————————————————————————————
naam functie affiliatie inzet
——————————————————————————————————————
Onderzoeker (aangevraagd) mol.bioloog Gezelschapsdieren 38 uur/week
Prof. dr. B.A van Oost geneticus Gezelschapsdieren 4uur/week
Mw T. Wessel-van Putten zie aantekening1)Felikat 1 uur/week
Dr. B.W. Knol dierenarts Gezelschapsdieren consultant
Prof. dr. E. Gruys dierenarts Pathologie consultant
Dr. J.S. Linde-Sipman dierenarts Pathologie consultant
Drs. A.van Dongen dierenarts Gezelschapsdieren consultant
Dr. G. Voorhout dierenarts Afdeling Radiologie consultant
——————————————————————————————————————
1) voorzitter commissie gezondheid en welzijn Felikat en lid van de commissie gezondheid en welzijn van het OP
Klankbordgroep
Een klankbordgroep zal het projectteam tijdens de uitvoering van het onderzoek adviseren. Deze commissie bestaat uit de volgende leden:
——————————————————————————————————————
Dr. P.O.Gerrits huidige voorzitter Overleg Platform Nederlandse Cat Fancy.
Mw. Y.E.W. Lankhaar-Heuzen Lid commissie gezondheid en welzijn van het OP
Dhr. S.W.M. Schiering secretaris OP
Dhr. H. Alstede Portefeuillehouder Stamboek Felikat.
Mw. Ir. L.A.M. Kuijpers Ministerie LNV/DL.
——————————————————————————————————————
10. Werkplan
Maand 1 – 4: inwerken op het laboratorium en literatuuronderzoek
Maand 1 – 36: verzamelen klinisch materiaal
Maand 4 – 42: opsporen van het genetische defect en ontwikkelen van de testen
Maand 28 – 42: toepassen testen in kattenpopulatie
Maand 41 – 48: mondelinge en schriftelijke verslaglegging van gehele project
11. Aangevraagde steun
Project kosten (inclusief overhead)
AIO-er 4 jaar fulltime aanstelling: f. 220 131,-
Laboratorium kosten over 4 jaar : f. 180 000,-
Totaal : f. 400 131,-
Toelichting: Voor het onderzoek is een pas afgestudeerde academicus met kennis van moleculaire genetica vereist die redelijk zelfstandig kan werken. De laboratoriumkosten hebben betrekking op de benodigde reagentia om de moleculair-biologische experimenten uit te voeren en een bijdrage in de kostbare DNA-sequencing apparatuur. Ook is hierin begrepen de aanschaf van een PC voor dataverwerking en onderzoek van gegevensbestanden op het internet en reiskosten om workshops op het gebied van de genetica van de kat en om werkbezoeken af te leggen bij collega onderzoekers in het buitenland.
Specificatie van de benchfee per jaar:
————————————————————————————————————-
DNA sequencing kits f. 8000,-
Oligonucleotides f. 4000,-
Verbruiksmiddelen laboratorium f. 6000,-
Afschrijving computer f. 1000,-
(Internationale) reiskosten f. 3000,-
Publicatie kosten f. 2000,-
Bijdrage DNA sequencing apparatuur f. 6000,-
—————————————————————————————-
12. Opinieverslag
Erfelijke ziekten leveren een belangrijke bijdrage aan de welzijnsproblematiek bij raskatten. In een aantal gevallen kan dit een relatie hebben met de rasstandaard. In de meeste gevallen, zoals met amyloïdose en polycysteuze nieren, is dit echter niet zo. De werkgroep fokkerij van de Raad voor Dieraangelegenheden houdt zich momenteel intensief met deze materie bezig en bezint zich onder andere ook op maatregelen. Mogelijke maatregelen om erfelijke ziekten te voorkomen zonder aan het ras zelf schade te berokkenen zijn ten zeerste afhankelijk van goede diagnostische methoden. Binnen de Hoofdafdeling Geneeskunde van Gezelschapsdieren worden nu sinds een aantal jaren methoden ontwikkeld om DNA defecten voor erfelijke ziekten aan te tonen. Daarnaast bestaat binnen de Hoofdafdeling Pathologie een lange onderzoekstraditie op het gebied van het ontstaan van het ziektebeeld amyloïdose bij verschillende diersoorten.
De samenwerking van kattenfokkers met de twee Hoofdafdelingen van de Faculteit Diergeneeskunde vormt de best mogelijke uitgangspositie om tastbare resultaten te boeken.
Utrecht, 2 maart 2000.
Drs. T. Ernst Prof. B. A. van Oost
Manager Bedrijfsvoering Veterinaire Klinische en Moleculaire Genetica